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限制性內切酶的一般原則和建議

發布時間: 2022-06-24  點擊次數: 66次
  限制性內切酶的一般原則和建議
  DNA中加上酶,然后保溫一段時間就可以了。但是在實際操作過程中,我們不斷聽到:切不動,裝不上。問題在什么地方?能系列生產限制性內切酶的公司國際上,就那么幾個,位列前3的是NEB,Fermentas,SibEnzyme。這些公司提供酶的品質一般都能得到保證。您可以懷疑酶的質量問題,但是更多的問題來源于模板是否合適酶切要求。下面幾點對你的酶切是有幫助的。
  1)成功酶切的關鍵是準備好模板DNA。DNA樣品中不能含有有機溶劑(會使酶變性或產生星號貨性),不能含有干擾酶活性的污染物質,不能含有高濃度的EDTA(TE中的EDTA濃度較低,對Mg的濃度影響較小);同時要對DNA甲基化程度及其對酶切效率的影響要做到心中有數。
  2)選用合適的酶。根據酶切序列選用,特別注意選用甲基化對酶活性的干擾。
  3)正確使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低溫環境中,只是在需要用酶才從冰箱中取出來。運輸和臨時存放時需要將酶至于冰上。手拿酶管時不要接觸酶管下步含酶的部分,移酶時盡可能用長TIP,避免污染。用完后需要及時送回原處。注意:酶通常是最后加。
  4)反應體積需要根據實驗目的定,常規的酶切一般要維持在10-50ul,酶切鑒定10-20ul就可以了。
  5)模板濃度問題:濃度過高,溶液黏度過大,酶不能有效擴散,酶切效果不會好。濃度過低,也會影響酶活性。
  6)注意模板用量和反應體積的關系。對酶用量,模板用量,反應體積等要素的確定需要的是時間和經驗的積累。
  7)酶切反應的各個組分加完后,需要用TIP小心混勻幾次,shortspin一下就可以保溫了。一般不能使用振蕩器混勻。
  8)反應溫度的選擇。一般反應都用37度,但是SmaI的適合溫度是25度,37度時酶仍表現出活性,但是效率下降50%。部分從耐熱菌制備的酶需要在37度以上的溫度反應,如TaqI的最適溫度為65度,37度保溫,效率僅為前者的1/10。
  9)反應時間的選擇。一般酶切鑒定30分鐘就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶長時間反應,或較高的酶量短時間處理都可以達到。在使用高酶量的時候需要注意甘油的最終濃度不要超過5%,也就是說10ul的體系,酶的用量不要超過1ul。
  10)是否和如何終止反應?酶切鑒定之類的實驗不需要特殊處理。滅活的手段:加入高濃度的EDTA;65度或80度熱處理20-30分鐘;部分從高溫菌純化出來的內切酶由于最適的反應溫度比較高,熱處理滅活不一定完全,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法純化;電泳回收也是實驗室常用除酶的手段。
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